酵母双杂交法的原理是利用AD和BD之间的位置接近，来鉴定蛋白结合能力。该方法通过将检测蛋白连接到AD（Activation Domain）上，将诱饵蛋白连接到BD（Binding Domain）上。若检测蛋白与诱饵蛋白相互结合，AD和BD会靠近，这样BD就能结合到UAS（Upstream Activation Sequence），AD则结合到转录起始位点，从而激活报告基因的表达。通过观察被激活的报告基因所表现出的特性，我们能够判断这两种蛋白是否具有结合能力。如果没有这些特性的观察结果，则说明这两种蛋白没有结合能力。
